El desarrollo de la PCR

Multiplicar las muestras de ADN con una sencilla técnica

kary-mullisEn 1979, el joven bioquímico Kary Mullis fue fichado por la empresa Cetus. Meses antes, el investigador había asistido a un seminario en el que explicaban cómo se podía sintetizar químicamente el ADN. Aquella charla, sin duda, marcó un antes y un después en la carrera del científico.

Mullis estaba a punto de despegar. Y es que no sólo había sido fichado por una de las primeras compañías biotecnológicas del área de San Francisco. Dos años después de su contratación, la empresa acudía a una oferta pública de venta (IPO, por sus siglas en inglés), y conseguía vender sus acciones por valor de 108 millones de dólares: un auténtico hito en la historia de la biotecnología de la época.

No sería aquella IPO la que llevaría la cima del éxito a Cetus Corporation. Sería el joven Mullis el que conseguiría la fama mundial de la biotecnológica. En su discurso de aceptación del Premio Nobel de Química de 1993, el bioquímico explica cómo la idea del descubrimiento de la PCR se le ocurrió de camino a casa mientras conducía:

But what if the oligonucleotides in the original extension reaction had been extended so far they could now hybridize to unextended oligonucleotides of the opposite polarity in this second round. The sequence which they had been extended into would permit that. What would happen?

EUREKA!!!! The result would be exactly the same only the signal strength would be doubled.

EUREKA again!!!! I could do it intentionally, adding my own deoxynucleoside triphosphates, which were quite soluble in water and legal in California.

And again, EUREKA!!!! I could do it over and over again. Every time I did it I would double the signal. For those of you who got lost, we’re back! I stopped the car at mile marker 46,7 on Highway 128. In the glove compartment I found some paper and a pen. I confirmed that two to the tenth power was about a thousand and that two to the twentieth power was about a million, and that two to the thirtieth power was around a billion, close to the number of base pairs in the human genome. Once I had cycled this reaction thirty times I would be able to the sequence of a sample with an immense signal and almost no background.

La autopista 128 había sido testigo de la creación de una de las técnicas más importantes en biología molecular: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Gracias a esta herramienta, los investigadores pueden actualmente obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN en particular, partiendo de una muestra genética mínima.

La reacción en cadena de la polimerasa se utiliza a diario en miles de laboratorios de todo el mundo. Diseñada según el principio natural de la replicación del ADN, la PCR ha cambiado la forma en la que se lleva a cabo la investigación y diagnóstico médico. Gracias a esta herramienta, hoy podemos identificar a sospechosos criminales mediante la identificación de pequeños restos biológicos, mejorar el diagnóstico de pacientes con SIDA o hepatitis C e incluso, llegar a secuenciar por completo el genoma humano.

¿Cómo se realiza una PCR?

Como explican en el vídeo anterior, para llevar a cabo una reacción de PCR necesitamos los siguientes ingredientes:

  • Los cuatro desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), necesarios para sintetizar el ADN.
  • Dos cebadores (primers en inglés), complementarios a las dos hebras de ADN, que permiten que la enzima polimerasa inicie la reacción. Son oligonucleótidos, es decir, secuencias cortas de ADN que oscilan entre 6 y 40 nucleótidos.
  • Iones divalentes como Mg2+, y monovalentes como el potasio, que actúan como cofactores de la enzima polimerasa.
  • Una solución tampón o buffer para mantener el pH óptimo para el correcto funcionamiento de la polimerasa.
  • ADN polimerasa (generalmente se usa la Taq polimerasa).
  • ADN molde, que contiene la región que amplificaremos mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
  • Termociclador, aparato que controla los cambios de temperatura necesarios para realizar la PCR.

ciclos-pcr

Mediante los ingredientes anteriores, la reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo mediante una etapa inicial (donde se sube la temperatura a los 94-96ºC), una fase de desnaturalización (para separar las cadenas de ADN), otra de alineamiento y unión del cebador que precede a la etapa de extensión o elongación de la cadena. En la fase final, conocida como de conservación, el termociclador reduce la temperatura a los 4-15ºC para mantener la reacción durante un tiempo más.

Las patentes de Cetus Corporation sobre la técnica de la PCR fueron después licenciadas a Hoffmann-La Roche por valor de 300 millones de dólares. Por último, Kary Mullis recibiría el Premio Nobel de Química en 1993, junto con el científico Michael Smith.

 

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